摘要: 通过敲除Pichia pastoris X33 野生型菌株中的Och1基因而得到的Pichia pastoris X33 α-1,6甘露糖转移酶(Och1p)突变株（och1 mX33），作为宿主菌表达外源蛋白时，极大地改善了野生菌株过度糖基化的弊端。但其生长缓慢，对外界环境因素敏感，蛋白表达成本高。

为促进Pichia pastoris X33 α-1,6甘露糖转移酶(Och1p)突变株（och1 mX33）作为蛋白表达宿主菌的应用，提高Pichia pastoris X33突变株的生长速度，改善其生长状态，提高外源蛋白在Pichia pastoris X33突变菌株中的表达量，本课题针对（1）接种量、通气量、培养基pH值、碳源含量（甘油含量）、外界环境渗透压（培养基中加入山梨醇）及培养温度六项可能影响酵母生长的外界因素；（2）诱导表达阶段的温度、pH、甲醇含量三项因素，进行研究，发现pH 5.0、培养基中添加0.1 mol/L山梨醇的单因素条件可加快Pichia pastoris X33突变菌株的生长速度，诱导温度为28℃、诱导pH为7.0、甲醇终浓度为2%的条件可改善改造菌株外源蛋白的表达。生长条件和表达条件的优化提高了Pichia pastoris X33突变株作为宿主菌应用的可行性。

关键词：培养条件；优化；蛋白表达；毕赤酵母X-33

目录

摘要

ABSTRACT

第1章 绪论-1

1.1 立题背景-1

1.1.1 糖蛋白-1

1.1.2 毕赤酵母表达系统的缺陷-1

1.1.3 毕赤酵母N-糖基化改造国内外研究背景-2

1.1.4 毕赤酵母X-33 Och1缺陷型菌株的生理性状、优点及存在问题-3

1.2 研究思路和内容-4

1.3 拟解决的主要问题及研究意义-5

第2章 实验材料与方法-7

2.1 实验材料-7

2.1.1 菌种-7

2.1.2 试剂-7

2.1.3 培养基-7

2.1.4 主要仪器-8

2.1.5 主要溶液配制-8

2.2 实验方法-9

2.2.1 种子活化-9

2.2.2 菌体条件优化培养及曲线测定-9

2.2.3优化后蛋白表达量的比较-12

第3章 实验结果与分析-15

3.1 Pichia pastoris X33野生型菌株和Pichia pastoris X33突变菌株在标准条件下的生长曲线-15

3.2 培养条件的优化-15

3.2.1不同接种量对于Pichia pastoris X33突变菌株生长情况的影响-15

3.2.2 BMGY培养基不同的pH对Pichia pastoris X33突变菌株生长情况的影响-16

3.2.3培养基中不同碳源（甘油）含量对于Pichia pastoris X33突变菌株生长的影响-17

3.2.4不同温度对Pichia pastoris X33突变菌株生长的影响-17

3.2.5不同通气量对Pichia pastoris X33突变菌株生长情况的影响-18

3.2.6在培养基中添加不同浓度的山梨醇对Pichia pastoris X33突变菌株生长情况的影响-18

3.3 GM-CSF在Pichia pastoris X33野生菌和改造菌中的表达情况-21

3.3.1 野生型X33高产菌株的筛选-21

3.3.2 X33野生和改造菌株GM-CSF的表达-22

第4章 结论与展望-25

4.1结论-25

4.2不足之处及未来展望-25

参考文献-26

致  谢-28